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**組織化學抗體的稀釋度、滴加與操存
《一》實驗計劃
每次實驗前應列出詳細實驗計劃,其中包括實驗目的、擬用方法、所用一抗和二抗的種類和效價、預實施的操作流程方案以及預期實驗結果等。實驗分組編號用玻璃筆標記在玻片上,對每一抗體均應配以陽性和陰性對照。
《二》抗體的稀釋度
抗體稀釋度,即抗體濃度。組織中抗原的**染色是通過適宜的抗體溶液系統而得以定性和定位,因而抗原與抗體濃度的比例十分重要。*佳的抗體稀釋度可提高染色質量,與周圍組織或細胞形成良好的染色對比。如果抗體濃度過高,反而減少抗體與抗原的結合,甚至導致假陰性結果,故各實驗室每當使用一種新抗體時,必須試用多種稀釋度,從中確定*佳工作濃度,以防假陰性結果的出現。由于標本的固定、切片種類、稀釋液種類和濕盒等具體條件均可影響稀釋度,故在測試之前必須使這些條件穩定。稀釋度應選擇陽性反應著色*強、背景著色*弱的滴度。
不同濃度BMP4對ChAT陽性**反應細胞數量的影響
目前,許多實驗室常用濃縮型一抗,使用前稀釋成工作濃度的稀釋方法見。由于市售的常用二抗,即生物素化IgG,一般由試劑公司配成即用型,并裝入**組織化學試劑盒內,故不必測試二抗工作濃度。
確定一抗*佳工作濃度方法
從中可以看出,在一抗稀釋度1:100和1:200之間可找出*佳稀釋度。
《三)滴加抗體注意事項
切片在血清封閉后,傾去多余血清,便可滴加**抗體。滴加前取出玻片,用吸水紙拭去組織周圍的液體,組織與細胞表面的液體要用濾紙條輕輕吸掉,但注意勿使組織干燥,盡快滴加抗體工作液1滴(約50ul)于組織表面。由于切片周圍無液體,滴加的抗體成為一個液滴,這樣既可節省抗體,又可增加抗原與抗體結合的機會。如果玻片上是培養細胞,應在鏡下選擇一個理想的區域用**組織化學油筆在此區域外圍畫一圓圈,再滴加抗體,爾后應輕輕搖動切片數秒,以促進抗體與組織待測抗原的結合,避免假陰性小區的出現。這一操作過程雖然簡單,卻十分重要。加抗體時切忌加樣器或吸頭碰到組織或細胞,以免造成破損。
《四》抗體的操存
1.抗體分裝購人的濃縮型抗體,為避免反復凍融而失效,一般需要分裝在多個安瓿中,根據需要量,每安瓿含10一20rA。除留一支現用,其余應立即放置低溫冰箱內貯存(-20℃以下)。用時取一支。以免長期保存在4℃冰箱內失效。
2.抗體稀釋一般按其工作濃度稀釋,如1:100、1:1000等,然后用旋渦器混勻液體。剩余的抗體可保存在斗℃冰箱內.盡量在1—2個月內用完,而不要放在0℃以下。否則抗體會很快結冰,反復凍融可使抗體效價急劇下降。對于抗體的稀釋液,在夏天溫度很高時,*好加入少許防腐劑如疊氮鈉或柳硫汞等,以免在切片上作用時間超過10小時而生**。
3.無菌與**保持使用中的抗體無菌是困難的,但是與抗體接觸的工具如滴管、吸管、試管、安瓿以及加樣器等*好經過**,盡量減少污染的機會.否則抗體極易污染**與**,從而迅速發生渾濁沉淀而失效。
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